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蛋白質(zhì)檢測(cè)方法
蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法:測(cè)定食物中的蛋白質(zhì)含量有二種方法,一是凱氏微量法,二是自動(dòng)定氮分析法。
一.凱氏微量法(蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法)
有手工滴定定氮和自動(dòng)定氮儀定氮,實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)經(jīng)濟(jì)條件設(shè)備而定。
1.原理
蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解,分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用過(guò)量硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù),即為蛋白質(zhì)含量。
2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 (NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
(NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4
2.方法
本法參照GB 5009.5 -85
適用于各類食品及飼料中蛋白質(zhì)的測(cè)定
3.試劑
所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制。試劑均為分析純。
3.1硫酸銅
3.2硫酸鉀
3.3濃硫酸
3.4 2%硼酸溶液(或1%的硼酸)
3.5混合指示劑:1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶與1份0.1%次甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合。
3.6飽和氫氧化鈉:500g氫氧化鈉加入500ml水中,攪拌溶解,冷卻后放置數(shù)日,澄清后使用。
3.7 0.01mol/L或0.05mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:需標(biāo)定后使用(配制及標(biāo)定方法見附錄)
4.儀器
消化爐凱氏定氮蒸餾裝置萬(wàn)分之一電子天平
凱氏定氮蒸餾裝置
5. 操作步驟
5.1樣品處理:精密稱取0.1~2.0g固體樣品或2~5g半固體樣品或吸取液體樣品5~20ml,放入100ml或500ml凱氏燒瓶中,加入0.2g硫酸銅,0.3g硫酸鉀及3~20ml濃硫酸,放置后小心加熱,待內(nèi)容物全部炭化,泡沫*停止后,加強(qiáng)火力,并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸,至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后,取下放冷后用約2~10ml蒸餾水沖洗瓶壁,混勻后繼續(xù)加熱至液體呈藍(lán)綠透明,取下放冷,小心加10~20ml水混勻,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白實(shí)驗(yàn)。
5.2按圖裝好定氮裝置,于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至約2/3處,加甲基紅指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸,加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。
5.3向接收瓶?jī)?nèi)加入10ml,1~2%硼酸溶液及混合指示液1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10ml樣品消化稀釋液由小玻璃杯流入反應(yīng)室,并以10ml水洗滌小燒杯使之流入反應(yīng)室內(nèi),塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將3~10ml飽和氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯中,提起玻璃塞使其緩緩流入反應(yīng)室,立即將玻璃塞蓋緊,并加水于小玻璃杯中以防漏氣。加緊螺旋夾,開始蒸餾。蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過(guò)冷凝管而進(jìn)入接收瓶?jī)?nèi),蒸餾2min,移動(dòng)接收瓶,使冷凝管下端離開液面,然后用少量中性水沖洗冷凝管下端外部,再蒸餾1min取下接收瓶,以0.01或0.05mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)。
同時(shí)吸取10ml試劑空白消化液按5.3操作。
6. 計(jì)算
X = (V-V0 )×C× 0.014× B/m ×100× F
式中:
X 一樣品中蛋白質(zhì)含量,g/100g;
V 一樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積,ml;
V0 - 空白消化液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積,ml;
C 一鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液摩爾濃度,mol/L;
0. 014一 1mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液1 ml相當(dāng)?shù)藬?shù).
B 一定容體積/取液量
m 一樣品的質(zhì)量,g;
F 一氮換算為蛋白質(zhì)計(jì)算因子。蛋白質(zhì)的氮素含量不同,故換算因子不同。詳見下表。
蛋白質(zhì)計(jì)算因子
食物計(jì)算因子
蛋,魚,肉及制品,禽類,玉米,高粱,豆類,水果和蔬菜類 6.25
乳及乳制品 6.38
大米 5.95
小麥面普通粉 5.70
全麥,大麥,燕麥,裸麥,小米,小麥面全麥 5.83
小麥 5.80
黃豆 5.71
花生 5.46
芝麻,向日葵,核桃和榛子 5.30
麩皮 6.31
7. 舉例
設(shè)取樣品0.1000g,消化后稀釋至100 ml; 。取10 ml樣品稀釋液,標(biāo)準(zhǔn)鹽酸為0.01 mol/L ,空白滴定為0.12ml; ,樣品滴定用去的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸為3.21 ml; ,測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)百分率為:
(3.21-0.12)×0.01×0.014×10/0.01× 100× 6.25
=(3.21-0.12)×8.75=27.0%
8. 附錄:
(1)標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液(0.1 mol/L HCl)配制及標(biāo)定:
配制:量取9毫升HCl,加適量水稀釋至1000毫升。
標(biāo)定:稱取約0.15克左右在270~300℃干燥至恒重的基準(zhǔn)無(wú)水碳酸鈉,加50毫升水使之溶解,加10滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示液,(量取30ml0.2%溴甲酚綠乙醇溶液,加入20ml0.1%甲基紅乙醇溶液,混勻)用配制的鹽酸滴定至溶液由綠色變紫紅色,煮沸2min,冷卻至室溫,繼續(xù)滴定至溶液由綠色變?yōu)榘底仙M瑫r(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。
(2)計(jì)算:
C = m
(v-v0)×0.0530
C - HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實(shí)際濃度,mol/L
m - 基準(zhǔn)無(wú)水碳酸鈉的質(zhì)量,g;
v - HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用量,ml;
vo - 試劑空白HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用量,ml;
0.0530-1.00 ml HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液〔C(HCl)=1mol/L〕相當(dāng)基準(zhǔn)無(wú)水碳鈉g。
0. 01mol/L HCl:吸取標(biāo)定過(guò)的0.1mol/L HCl 10 ml,準(zhǔn)確稀釋至100毫升。必要時(shí)重新標(biāo)定濃度。
9.注意事項(xiàng):
9.1干樣用稱量紙稱重連紙一同消化,空白管同樣放稱量紙消化。
9.2 含糖量高和油脂高的樣品消化時(shí)容易溢出,加熱要緩慢。
9.3 稀釋樣品時(shí)消化液過(guò)熱,加水反應(yīng)猛烈使樣品損失;消化液過(guò)冷,加水后鹽析不溶解。
二、自動(dòng)定氮分析法(蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法)
1.原理
本方法為凱氏微量定氮法,將蛋白質(zhì)的氮素轉(zhuǎn)化成氨,與硫酸化合成硫酸銨,然后測(cè)定氨量。由此計(jì)算出氮素含量,再乘以相應(yīng)的系數(shù)即為蛋白質(zhì)含量?;瘜W(xué)反應(yīng)式如下:
2NH2(CH2)2COOH+13 H2SO4→(NH4)2 SO4+6CO2+12 SO2+16H2O
(NH4)2 SO4+2NaOH→2 NH3+2H2O + Na2SO4
2.方法來(lái)源
GB/T 6432-94 本法適用于各種食物和飼料的測(cè)定
3.儀器
KJELTEC AUTO 1030 ANALYZER 40孔消化爐
4.試劑
本實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為分析純,所用水皆為蒸餾水
(1)濃硫酸 98% H2SO4
(2)凱氏片(催化劑)K2SO4 + Se
(3)40%氫氧化鈉溶液(NaOH) W/V
(4)無(wú)水硫酸鈉 Na2SO4
(5)1%硼酸(H3BO4)吸收液稱取100g硼酸溶于10L水中。加入100ml溴鉀酚綠溶液,再加入70ml甲基紅溶液,zui后加入3ml 4%氫氧化鈉溶液。
(6)0.1mol/L鹽酸(HCL)標(biāo)準(zhǔn)溶液,標(biāo)定后使用。
5.操作步驟
5.1樣品消化:稱取一定量的樣品于消化管中(半固體樣品用稱量紙稱?。?,加一粒凱氏片于消化管中,然后加入5ml濃硫酸,放置,同時(shí)做樣品空白管。在消化過(guò)程中,先用低溫消化(防止高溫消化時(shí)樣品溢出),低溫消化1小時(shí)后,將溫度升到zui,至消化液無(wú)色透明。待消化液冷卻后,加入少量水沖洗消化管內(nèi)壁,振搖,以免內(nèi)壁粘有樣品以致消化不*。然后于消化爐上再消化,直至液體無(wú)色透明。放置室溫后,加水至25ml,待測(cè)。
5.2樣品定氮:開啟1030自動(dòng)分析儀電源,輸入測(cè)定時(shí)的參數(shù),打開STEAM按鈕,產(chǎn)生蒸氣5分鐘,同時(shí)調(diào)節(jié)蒸氣表,使蒸氣表的指針指到NORMAL。zui后將消化管裝入,關(guān)閉安全門,開始自動(dòng)定氮。當(dāng)CYCLEOVER燈亮?xí)r,記錄滴定結(jié)果,打開安全門,進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。
6.計(jì)算
蛋白質(zhì)(g/100g)= (V-V0)×0.01401×N×f/m×100
V:樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積,ml;
V0:試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積, ml;
N:鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度, mol;
0.01401:1mol鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)
f:氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)(一般樣品的系數(shù)為6.25);
m:樣品的質(zhì)量,g;
7.注意事項(xiàng)
7.1 對(duì)含糖高的樣品或油脂樣品在消化過(guò)程中必須先低溫消化,防止樣品溢出,消化所需時(shí)間較長(zhǎng)。
7.2 樣品的稱樣量不宜過(guò)多,否則試劑消耗多,消化時(shí)間長(zhǎng),適宜稱樣范圍在0.05~2.00g之間。
7.3 消化液過(guò)冷,在加水時(shí),消化液有鹽析出。將消化管放在消化爐上加熱,使沉淀溶解。
7.4 使用自動(dòng)分析儀時(shí),定氮前,應(yīng)將管路中的吸收液排出去,因?yàn)楣苈分械奈找洪L(zhǎng)時(shí)間停留會(huì)變色。
7.5 在產(chǎn)生蒸氣的水中加入無(wú)水硫酸鈉是為了提高水中的電解質(zhì)。
7.6 本儀器消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量*范圍在0.5~7ml。
聯(lián)系方式
郵件:sh-jiapeng@163.com