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RNA實(shí)驗(yàn)和方案新手必讀(四)
更新時(shí)間:2015-07-03 點(diǎn)擊次數(shù):1312

 RNA定量

 

在檢測RNA樣本時(shí),需確保比色杯中去除了RNA酶,特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。該條件可通過使用0.1 M NaOH,1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實(shí)現(xiàn)。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計(jì)設(shè)定空白對照。

   使用分光光度法測定RNA濃度

在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度計(jì)中,測量260 nm的吸光值(A260)以確定RNA的濃度。為了確保獲得有意義的結(jié)果,讀值應(yīng)在0.15與1.0之間。在260 nm波長下,1個(gè)單位的吸光值對應(yīng)每毫升44 μg的RNA濃度(A260=1 → 44 μg/ml;基于標(biāo)準(zhǔn)的1 cm測光距離)。這一相關(guān)性僅對中性pH值條件下的檢測有效。因此,如需稀釋RNA樣品,則應(yīng)使用中性pH值的低鹽緩沖液(例如10 mM Tris?Cl ,pH7.0)。

在檢測RNA樣本時(shí),需確保比色杯中去除了RNA酶,特別是在使用分光光度測定之后仍需回收這些RNA的情況下。這可以通過使用0.1 M NaOH,1mM EDTA和不含RNase的水的順序洗滌來實(shí)現(xiàn)。使用稀釋RNA的緩沖液為分光光度計(jì)設(shè)定空白對照。列舉一個(gè)RNA定量中的計(jì)算實(shí)例如下:

RNA定量舉例
RNA樣品的體積= 100 μl
稀釋=10 μl RNA樣品+490μl 10 mM Tris?Cl ,pH 7.0(1/50的稀釋比)
使用1 ml(已去除RNA酶)比色杯,檢測稀釋后樣本的吸光度
A260 = 0.2

RNA濃度
= 44 μg/ml x A260 x稀釋系數(shù)
= 44 μg/ml x 0.2 x 50 
= 440 μg/ml

RNA總量 
=濃度x以毫升為單位的樣品體積
= 440 μg/ml x 0.1 ml 
= 44 μg RNA

 

   確定RNA的品質(zhì)

RNA純度

在260 nm與280 nm讀值之間的比例(A260/A280)能夠反映RNA的純度,因?yàn)槿绲鞍滓活惖奈廴疚飼兆贤夤狻2贿^,A260/A280的比值也受到pH值的顯著影響。當(dāng)使用沒有緩沖能力的水時(shí),pH值與A260/A280的比值結(jié)果都會發(fā)生大范圍的改變。 較低的pH值會導(dǎo)致A260/A280的比值變小,對蛋白質(zhì)污染的敏感性也會隨之降低(3)。

為了獲得的比率,我們建議在微堿的低鹽緩沖液中檢測吸光度(例如10 mM Tris?Cl,pH7.5)。在10 mM Tris?Cl,pH 7.5緩沖液當(dāng)中,純RNA的A260/A280 比率約為1.9–2.1。

注:某些分光光度計(jì)在檢測純RNA時(shí),可常規(guī)獲得高達(dá)2.3的比值。

請確保使用同種溶液校準(zhǔn)分光光度計(jì)。不過,為了準(zhǔn)確確定RNA的濃度,我們?nèi)越ㄗh使用中性緩沖液稀釋RNA樣本,因?yàn)槲舛群蜐舛龋ˋ260讀值為1相當(dāng)于44 μg/ml的RNA濃度)之間的關(guān)系是一個(gè)基于中性條件獲得的吸光系數(shù)。

RNA的完整度

總RNA的完整度和大小分布可以通過變性的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色或市售的檢測系統(tǒng)(如QIAxcel系統(tǒng)或Agilent 2100 )進(jìn)行檢測。每條核糖體RNA的富集區(qū)域在凝膠染色之后應(yīng)顯現(xiàn)為銳利的條帶。28S核糖體RNA的條帶亮度應(yīng)為18S rRNA條帶的兩倍左右。如果某一泳道中核糖體RNA條帶不夠銳利,卻出現(xiàn)小尺寸RNA的彌散情況,則很可能因?yàn)镽NA樣品在制備過程中發(fā)生了嚴(yán)重的降解。

Agilent 2100 Bioanalyzer也能夠提供RNA完整數(shù)目(RNA Integrity Number,RIN)這一參數(shù),作為對RNA完整度的一個(gè)有用量度。在理想情況下RIN值應(yīng)接近10,不過在許多情況下(特別是對組織樣本來說),RNA品質(zhì)主要取決于原始樣本的保存情況。

不同來源的核糖體RNA大小

來源

rRNA

大小(kb)

E. coli

16S 
23S

1.5 
2.9

S. cerevisiae

18S 
26S

2.0 
3.8

小鼠

18S 
28S

1.9 
4.7

18S 
28S

1.9 
5.0

   RNA分析:分析凝膠

變性凝膠分析的原理

利用RNA在甲醛瓊脂糖凝膠中的電荷遷移效應(yīng),可對RNA進(jìn)行分離和鑒定。RNA不像DNA,它們具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu),因此需使用變性凝膠。凝膠中的甲醛能夠破壞RNA的二級結(jié)構(gòu),從而使得RNA分子嚴(yán)格按照電荷遷移的方式得到有效分離。

在電場中,主鏈磷酸基團(tuán)上所攜帶的負(fù)電荷使核酸分子向陽極移動。變性的RNA分子的遷移速率取決于它們的尺寸大小;不過片段大小與遷移速率之間并非線性相關(guān),因?yàn)楦蟮钠螘龅礁蟮哪Σ磷枇Γ谀z中移動更為困難。

瓊脂糖凝膠分析是zui為常用的RNA分析方法,通常依據(jù)RNA的大小相應(yīng)選擇合適分辨范圍的瓊脂糖凝膠。小的RNA片段,如tRNA或5S rRNA,可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。可查閱分子生物學(xué)手冊(2,4)以獲得關(guān)于各類分析膠的詳細(xì)信息。本節(jié)將針對甲醛瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行介紹。

制備用于RNA分析的甲醛瓊脂糖凝膠

下列甲醛瓊脂糖(FA)凝膠電泳方案能夠提高凝膠分離及后續(xù)檢測(例如RNA印跡)的靈敏度。本方案的關(guān)鍵特點(diǎn)在于使用了濃縮的RNA上樣緩沖液,從而(相比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方案)能夠向凝膠中載入更大量的RNA樣本。

瓊脂糖

用于制備凝膠的瓊脂糖是針對所分離RNA片段的大小來確定濃度范圍的。對于大多數(shù)的目的RNA種類來說,使用1.0–1.2%(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖濃度可獲得*結(jié)果。對于較大的mRNA種類,降低瓊脂糖濃度可能會有所幫助。如需分離更小的mRNA,瓊脂糖濃度可提高至2%。對于較小的RNA種類,如tRNA或rRNA,則推薦使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。

請使用超純瓊脂糖,因?yàn)槿缍嗵穷?、鹽類和蛋白一類的雜質(zhì)都會對RNA的遷移造成影響。

小貼士:某些電泳槽的塑料不耐乙醇。請對此適當(dāng)留意,并核對廠商的說明書。


Total RNA-甲醛瓊脂糖凝膠

每個(gè)泳道10ug RNA

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