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(一)原 理
由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制,因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)”和“不連續(xù)系統(tǒng)”兩種電泳系統(tǒng)。“不連續(xù)系統(tǒng)”大的特點在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點是:(1)使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng);(2)配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同,并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實驗中,電泳凝膠分為兩層:上層膠為低濃度的大孔膠,稱為濃縮膠或成層膠,配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl,pH6.7;下層膠則是高濃度的小孔膠,稱為分離膠或電泳膠,成膠的緩沖液是Tris-HCl,pH8.9。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸,pH8.3??梢?,凝膠濃度、成膠成分、pH與電泳液緩沖系統(tǒng)各不相同,形成了一個不連續(xù)系統(tǒng)。
電泳時,蛋白質(zhì)樣品放置在濃縮膠上,為防止蛋白質(zhì)樣品在電極緩沖液中擴散,因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合,以提高密度;為觀察蛋白質(zhì)樣品泳動的情況,樣品中還加入溴酚藍等示蹤染料,這些有色物質(zhì)的分子比任何一種大分子物質(zhì)泳動的速度都快,只要染料未泳動出凝膠管,樣品就沒有走出膠管的危險。
在不連續(xù)系統(tǒng)中,當接通電源開始電泳時,系統(tǒng)中的甘氨酸、蛋白質(zhì)、HCl中的氯離子和溴酚藍等均解離為陰離子,形成離子流向陽極泳動。其遷移率取決于離子的電荷數(shù)、分子量大小及形狀。然而,當電極緩沖液(pH8.3)中的甘氨酸離子在進入濃縮膠時,它們遇到了比pH8.3低的pH(6.7),pH下降了近兩個單位,幾乎接近于甘氨酸的等電點(5.97),于是甘氨酸的解離度突然降低,所帶電荷量明顯減少,遷移率減慢。血清樣品中個蛋白質(zhì)成分也進入濃縮膠,pH的改變雖對其解離度有影響,但比對甘氨酸要小得多,其遷移率比甘氨酸要大,而且濃縮膠的膠孔較大對蛋白質(zhì)分子不會造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離,分子量很小,摩擦力不大,其遷移率比蛋白質(zhì)、溴酚藍都快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成:甘氨酸<蛋白質(zhì)<溴酚藍
甘氨酸分子進入濃縮膠后解離度的下降,造成移動離子流的突然缺失,出現(xiàn)電流減小電導率下降。然而,整個電泳系統(tǒng)中其他部分的電流仍維持不變,根據(jù)電導及電位梯度成反比(E=I/n,E為電位梯度,I為電流強度,n為電導率)的關系,于是在前導離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個局部高電位梯度區(qū)域中的血清蛋白質(zhì)各成分,在高電場作用下迅速以不同的速度(分子量不同、帶電量不同)泳向前導Cl-離子區(qū)域。當?shù)竭_前導Cl-區(qū)域時因不缺少離子,大的電場強度減弱,離子移動速度急速減慢下來,其結(jié)果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質(zhì)樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過這個過程,是蛋白質(zhì)樣品濃縮了好幾百倍,且蛋白質(zhì)各成分也按一定的順序排列成層。
當離子流繼續(xù)向前,進入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時,蛋白質(zhì)分子在小孔膠里遇到阻力,遷移率減慢,同時在pH8.9條件下,甘氨酸又充分解離,其帶電量增加,消除了離子流缺失的現(xiàn)象,小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質(zhì)。凝膠各部分恢復具有恒定的電場強度,蛋白質(zhì)的分離*按一般區(qū)帶點用方式進行。
由以上的原理可見,聚丙烯酰胺凝膠的不連續(xù)電泳主要的優(yōu)點就是使蛋白質(zhì)樣品經(jīng)濃縮膠后,形成緊密地壓縮層進入分離膠。蛋白質(zhì)各成分預先分開且壓縮成層,可以減少在電泳時,成分間由于自由擴散而造成的區(qū)帶相互重疊所帶來的干擾,這樣就提高了電泳的分辨能力。由于這個優(yōu)點,少量的蛋白質(zhì)樣品(1-100??g)也能分離得很好,分辨率高使血清蛋白質(zhì)可獲得近20多個區(qū)帶。
(二)試劑和器材
1.測試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG、純化后的IgG。
2.試劑
(1)制備分離膠、濃縮膠有關試劑
① 凝膠緩沖液:稱取1mol/L HCl 48ml,Tris(三羥基氨基甲烷)36.6g,TEMED(N,N,N`,N`-四甲基乙二胺)0.23ml,加重蒸水至80ml使其溶解,調(diào)pH8.9,然后加重蒸餾水定容至100ml,置棕色瓶,4℃貯存。
② 分離膠貯液:28%Arc-0.735%Bis儲液:丙烯酰胺(Acr)28.0g,甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.735g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml。過濾后置棕色試劑瓶中,4℃ 貯存,一般可放置1個月左右。
③ 分析純過硫酸胺(AP)(AR) 0.14g加重蒸水至100ml,置棕色瓶,4℃儲存僅能用一周,好當天配制。上述3種試劑用于制備分離膠。
④ 濃縮膠緩沖液:稱取1mol/L HCl 48ml,Tris5.98g,TEMED 0.46ml,加重蒸水至80ml,調(diào)pH6.7,用重蒸水定容至100ml,置棕色瓶內(nèi),4℃貯存。
⑤ 濃縮膠貯液:稱Acr10g,Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml,過濾后置棕色瓶內(nèi),4℃貯存。
⑥ 40%蔗糖溶液(W/V)
⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg,加重蒸餾水溶解,定容至100ml,置棕色試劑瓶內(nèi),4℃貯存。
(2)Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液
稱Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml,調(diào)pH8.3后,用重蒸水定容至1000ml,置試劑瓶中,4℃貯存,臨用前稀釋10倍。
(3)0.1%溴酚藍指示劑
(4)染色液 染色液種類較多,染色方法也不*相同。本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250染色液中,含20%磺基水楊酸,其優(yōu)點是染色、固定同時進行,背景易脫色。0.5%考馬斯亮藍R250的20%磺基水楊酸染色液:考馬斯亮藍0.05g,磺基水楊酸20g,加蒸餾水至100ml,過濾后置試劑瓶內(nèi)保存。
(5)脫色液 7%乙酸溶液
(6)保存液 甘油10ml,冰乙酸7ml,加蒸餾水至100ml。
(7)1%瓊脂(糖)溶液 瓊脂(糖)1g,加已稀釋10倍的電極緩沖液,加熱溶解,4℃貯存,備用。
3.器材 電泳儀 夾心式垂直板電泳槽。
(三)操作方法
1.安裝夾心式垂直板電泳槽
夾心式垂直板電泳槽操作簡單,不易滲漏。這種電泳槽兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽,兩個電極槽中間夾有一個凝膠模,該模由一個上框形凝膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板(梳子)所組成。電泳槽由上儲槽(白金電極在上或面對短玻璃板),下儲槽(白金電極在下或面對長玻璃板)和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠儲液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝:
(1)將上儲槽和固定螺絲銷釘,仰放在桌面上。
(2)將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。
(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲槽上,短玻璃板應面對上儲槽。
(4)將下儲槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘?shù)纳蟽Σ?,雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽 。
(5)豎直電泳槽,在長玻璃板下端與硅膠??蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙,凝固后的瓊脂(糖)中應避免有氣泡。
2.配膠
① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中,凝膠緩沖液(pH8.9)2.5ml,分離膠貯液5.0ml,重蒸餾水2.5ml,充分混勻,抽氣10min,后加AP 10 ml。
② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA:濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。
3.制備凝膠板
不連續(xù)體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ,凝膠制備應分2步進行。
① 分離膠的制備:根據(jù)實驗要求,選擇終丙烯酰胺的濃度,本實驗需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液,其加膠方式不同于連續(xù)系統(tǒng)。混合后的凝膠溶液,用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi),加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約3-4mm)用于隔絕空氣,使膠面平整。為防止?jié)B漏,在上、下儲槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠*聚合,則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。用濾紙條吸去多余的水,但不要碰破膠面。如需預電泳,則上、下儲槽的蒸餾水倒去,換上分離膠緩沖液,10mA電流電泳1h,終止電泳后,棄去分離膠緩沖液,用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數(shù)次,即可制備濃縮膠。
② 濃縮膠制備:濃縮膠為pH6.7 25% PAA,混合均勻后用細長的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方),距短玻璃板上緣0.5cm處,輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲槽中加入蒸餾水,但不能超過短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處,用日光燈或太陽照射,進行光聚合,但不要造成大的生溫。在正常情況下,照射6-7min,則凝膠由蛋黃透明變成乳白色,表明聚合作用開始。繼續(xù)光照30min,使凝膠聚合*。光聚和完成后放置30-60min,輕輕取出樣品槽模板,用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體,加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒過玻璃板約0.5cm,即可加樣。
4.加樣
作為分析用的PAGE加樣量僅需幾微克,2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶。為防止樣品擴散,應在樣品中加入等體積40%蔗糖(內(nèi)含少許溴酚蘭)。用微量注射器取5ul上述混合液,通過緩沖液,小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部,待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品,即可開始電泳。
5.電泳
將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽連接,負極與上槽連接(方向切勿接錯)。接通冷卻水,打開電泳儀開關,開始時將電流調(diào)至10 mA 。待樣品進入分離膠時將電流調(diào)至20-30mA。當藍色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時,將電流調(diào)回到零,關電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中,4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲,取出硅橡膠框,用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移去,在膠板一端切除一角作為標記,將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。
6.固定,染色
本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250(內(nèi)含20%磺基水楊酸)染色液,染色與固定同時進行,使染色液沒過膠板,染色30min左右。
7.脫色
用7%乙酸侵泡漂洗數(shù)次,直至背景藍色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床,則可縮短褪色時間。脫色液經(jīng)活性碳脫色后,可反復使用。
聯(lián)系方式
郵件:sh-jiapeng@163.com